第三代慢病毒

第二代慢病毒

非整合慢病毒

服务详情

病毒类型

• VSV-G假病毒化的第三代慢病毒（默认）
• VSV-G假病毒化的第二代慢病毒
• 非整合慢病毒
• 使用其他膜蛋白进行假病毒化的慢病毒（如使用冠状病毒刺突蛋白）
• 无膜蛋白的表面光秃的慢病毒（可用于转导时的阴性对照）

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交付内容

对照病毒

为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：

辅助病毒

为了更好地开展您的实验，我们按照“辅助病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您推荐辅助病毒。例如，如果定制病毒是一个只含TRE启动子的TetOn慢病毒，则需要一个表达rtTA的辅助病毒，才能进行诱导表达实验。推荐的辅助病毒信息如下表所示：

运输/储存

我们的慢病毒存储在HBSS缓冲液中，并采用干冰运输。收到慢病毒后，立即放置于-80℃，长期贮存至少6个月。慢病毒的保质期约为一年。请避免反复冻融，因为这会导致慢病毒滴度大幅下降。

生产/质控

在我们的第三代慢病毒包装系统中，携带目的基因（GOI）的转移质粒与我们专有的VSV-G包膜质粒、以及编码Gag/Pol和Rev的包装质粒共同转染至HEK293T包装细胞。经过48小时培养后，收集上清液并通过离心去除细胞碎片，随后进行过滤处理。慢病毒颗粒随后采用聚乙二醇（PEG）法进行浓缩。对于超纯化慢病毒（体内应用级别），病毒颗粒还需经过蔗糖梯度超速离心进一步纯化，并通过超滤法进行浓缩。我们采用p24 ELISA法测定慢病毒滴度。

对于我们生产的每一个重组慢病毒，其质量控制包括滴度测定、细菌和真菌/无菌检测以及支原体检测。如果转移载体编码荧光蛋白，我们将进行转导测试以检测相应的荧光信号；若转移载体编码药物筛选标记，则会在转导测试后实施相应的药物筛选。此外，对于超纯化慢病毒，我们默认进行内毒素检测以评估内毒素水平。如需在质检报告（COA）中体现内毒素结果，需支付额外费用。其它质量控制服务可根据需求提供。

滴度保证

我们的滴度保证仅适用于这样的转移载体

• 载体上的慢病毒基因组（从5’ LTR的R元件的第一个碱基到3’ LTR的R元件的最后一个碱基）长度小于承载限度长度9.2 kb（～野生型HIV-1基因组长度）。超过该范围，载体上的病毒基因组也许会被包装进病毒，但会造成病毒滴度降低。

对于如下这样的转移载体，我们不能保证滴度：

• 包含对包装过程有不利影响的序列，例如毒性基因（如促凋亡基因、针对HIV的host factors）；破坏包装细胞完整性的基因（如导致细胞聚集的膜蛋白）、破坏慢病毒RNA基因组完整性的序列（如含有polyA信号序列）、易于重排或者产生二级结构的序列（如重复序列或者高GC含量序列）。
• 用户提供的载体，因为我们无法控制载体质量。

交付周期

交付周期是指订单接收到发货之间的时间，不包括需要客户提供任何物料（如病毒载体）的等待时间。对于不含有荧光标记，但是含有药筛标记的病毒载体，如果您需要获得细胞药筛效果的质检结果，由于细胞生长状态需要较长时间观察，周期将额外增加8-10天。

试验验证

我们开发了一系列专有技术用以优化慢病毒的包装效率。经过试验验证，我们的慢病毒无论在体外抑或体内的多种细胞和组织类型中均表现出很高的转导效率。.

 

基因过表达

图1 使用基因过表达载体、gRNA表达载体、以及shRNA表达载体包装的慢病毒分别转导HEK293T细胞，报告基因为EGFP和mCherry。转导后48 h对细胞成像。
 

图2 高通量gRNA慢病毒文库表现出很高的体外转导效率。（A）p24 ELISA测定96孔板中的慢病毒阵列文库的每孔的独立滴度（点）。（B）阵列慢病毒文库转导HEK293T细胞。HEK293T细胞首先在96孔板中培养，然后使用MOI 10转导gRNA阵列慢病毒文库。转导后48 h检测GFP表达。

 

图3 通过使用表达CAR的Jurkat细胞和表达CD19的靶细胞（Ramos细胞）检测表面CD69分子的上调，验证活化的CAR诱导的T细胞。（A）携带靶向CD19的CAR基因的慢病毒转导Jurkat细胞，与表达CD19的Ramos细胞共同培养。与CD19结合的Jurkat细胞被激活，表现出CD69表面抗原上调表达。（B）孵育后流式细胞术分析CAR jurkat细胞的激活程度。与CD19+Ramos细胞（蓝色）共同培养后的CAR jurkat细胞显著增加了CD69的表达量，表明Jurkat细胞在CAR介导下被激活。

图4 使用基于慢病毒的all-in-one CRISPR系统进行高效的基因编辑。（A）Cas9:T2A:Puro和打靶EGFP的gRNA共表达慢病毒载体以及Cas9:T2A:Puro和scramble gRNA共表达慢病毒载体分别被包装成慢病毒颗粒，各自转导稳定表达有EGFP的HEK293T细胞，MOI为10和50。使用嘌呤霉素进行药筛以分离得到转导阳性的细胞，显微镜下（100X）观察EGFP表达。（B）针对未转导的细胞（NC）以及转导有scramble gRNA、打靶EGFP的gRNA（EGFP-1和EGFP-2）的细胞，分别对gRNA的靶向的基因组区域进行PCR扩增。T7E1试验确认基因编辑效果。（C）流式细胞术量化EGFP阳性细胞数。（D）对于在MOI 10和MOI 50慢病毒转导的细胞，经过基因编辑后其EGFP阳性细胞比例分别降低至28-32%和8-14%。使用ANOVA统计分析数据，然后进行Dunnett事后检验。相对于gRNA scramble，***P<0.001。

图5 基于慢病毒的CRISPRa系统的基因上调表达效果。（A）SAM复合物示意图。首先向NIH3T3细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的慢病毒，进行抗性筛选。然后使用递送msgRNA的第三种慢病毒转导细胞，并用另一种抗生素进行筛选。（B）针对靶向mBrn2基因启动子区域而设计的msgRNA。（C） 通过qRT-PCR测量mBrn2的相对基因表达，量化了使用Scramble、msgRNA以及空白对照（NC）转导的并经过抗性筛选的NIH3T3细胞中mBrn2转录产物表达量。Mean±SD，*P<0.05，Turkey事后检验。

图6 基于慢病毒的CRISPRi基因抑制表达效果。（A）靶向CXCR4基因启动子区的gRNA。（B）通过western blot证实了含有打靶gRNA的Jurkat细胞中的CXCR4表达水平下调。（C）通过qRT-PCR测量CXCR4的相对基因表达，量化了使用Scramble、gRNA以及空白对照（NC）转导的病经过抗性筛选的Jurkat细胞中CXCR4转录产物表达量。Mean±SD，***P<0.001，****P<0.0001，Tukey事后检验。（D）转导了打靶CXCR4的gRNA的Jurkat细胞相较于转导了scramble gRNA的平均减少了50%细胞表面的CXCR4含量。Mean±SD。

图7 U6 shRNA慢病毒载体与miR30 shRNA慢病毒载体对EGFP的敲低效率比较。(A)U6启动子驱动的shRNA表达的慢病毒载体与miR30 shRNA（4条shRNA）慢病毒载体分别包装成慢病毒，然后转导稳定表达EGFP的HEK293T细胞。药筛前后流式细胞术检测EGFP表达情况。（B）药筛前，EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了46%（P<0.001）,在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（单shRNA）作用下减少了13%（P<0.001），在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（4条shRNA）作用下减少了44%（P<0.001）。（C）EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了72%（P<0.001）,在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（单shRNA）作用下减少了60%（P<0.001），在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（4条shRNA）作用下减少了67%（P<0.001）。EGFP的相对表达量通过转导与未转导细胞的荧光强度中值（Median fluorescence intensities，MFI）的比值计算。三次重复实验，图中显示SD值，p值根据Tukey检验计算。