间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，在一定条件下可以体外诱导分化为脂肪细胞、 成骨细胞、成软骨细胞，是 MSC 鉴定的必检项目，在多种组织来源和制作方法的 MSC 药品 质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。BDBIO 成脂诱导分化染色试剂盒可用于鉴 定人 MSC 是否具有成脂分化能力，满足 MSC 质量控制的要求，此外培养基还可用于研究诱 导分化过程中的其他检测，如 mRNA 检测、lncRNA 检测、microRNA 检测、蛋白表达检测、 油脂定量检测、免疫组化检测等。本产品诱导 MSC 分化为的脂肪细胞多为多泡脂肪细胞样， 当脂肪滴融合过大时容易脱壁，难见单泡脂肪细胞样，用于脂肪研究可斟酌使用本产品。 使用方法 1.试剂配制：完全诱导培养基B：2-8℃过夜融化成脂诱导添加物B，使用前须37℃复温30分钟至内容物充分解冻为透明无沉淀。将人间充质干细胞成脂诱导基础培养基平均分成2份，各45ml，加入成脂诱导添加物B配制成完全诱导培养基B，充分混匀。完全诱导培养基C：2-8℃过夜融化成脂诱导添加物C，加入人间充质干细胞成脂诱导基础培养基的另一份45ml，配制成完全诱导培养基C，充分混匀，2-8℃保存。油红O染液（工作液）：取油红O储液，与蒸馏水以3：2的比例混合均匀，中性滤纸过滤，即配制成了油红O染液（工作液），油红O染色工作液现配现用。2.培养皿处理：加适量室温复温的包被溶液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液，室温晾干。3.准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。4.按照3×104cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基（需自备）2ml，37℃、5%CO2培养箱中培养（细胞密度可根据实验室情况进行调整）。5.当细胞融合达90%时，弃去培养上清，每孔添加完全诱导培养基B2ml/孔，37℃，5%CO2培养箱培养。6.诱导培养72小时后弃去原培养上清，添加完全诱导培养基C2ml/孔，37℃、5%CO2培养箱继续培养。7.继续诱导培养24小时后弃去原培养基，添加完全诱导培养基B2ml/孔，37℃、5%CO2培养箱继续培养。8.重复步骤6、7约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为完全诱导培养基C继续培养（一般骨髓间充质干细胞在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡，5-9天融合为较大的亮泡，这些结构围绕在细胞核周围，较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程，若10天后仍未见脂滴结构，请注意分析操作步骤与其他原因。脐带等组织来源的细胞时间可能不同，需根据具体情况判断）。9.每2天更换新鲜完全诱导培养基C，继续培养至脂滴足够大时培养结束（根据实验需要选择培养结束时间，若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现，建议提前终止。诱导终止时间以脂滴大小或拟定的对照时间为准，一般最长不超过40天）。10.诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2ml/孔室温固定细胞20分钟（培养结束时或中途也可以选择其他检测方法，如基因表达检测等）。11.弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液（工作液）1ml/孔染色15分钟。该步骤适用于鉴定成脂能力，若出现脂滴（脂肪细胞）则会呈现红色着色。染色时间需实际情况确定。12.弃去油红O染液（工作液），DPBS洗3次，添加新鲜DPBS。13.显微镜下观察并拍照。14.结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则，所使用的MSC无成脂能力。 注意事项 1.成脂诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，避免吹起细胞。2.细胞起始诱导时，融合度对诱导效果十分关键，必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。3.换液时诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。4.染色工作液现配现用。5.染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。6.如果试剂外包装管出现裂缝，应立即停止使用。7.应严格按照贮存要求贮存，避免反复冻融。8.操作过程应在无菌环境下进行，必须保证操作过程中使用的所有容器及所有直接接触细胞液的器具严格无菌。 声明 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 保存条件