细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）是一种基于 WST-8 在电子耦合试剂存在 的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜产物（formazan），生成的甲臜物的 数量与活细胞的数量成正比，使用酶标仪在 450nm 波长处测得的吸光值即可间接反映活细 胞的数量。细胞增殖越快，则颜色越深，细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜 色的深浅和细胞数目呈线性关系。CCK-8 广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度 检测。 BDBIO 细胞计数试剂盒（CCK8）仅一管已经配制好的含有 WST-8 的 CCK-8 溶液，无须再 进行任何配制操作，并且不必洗涤或收集细胞，使用便捷，加入 CCK-8 溶液显色后，可以在 不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间，可以用于大批量 样品的检测。 使用方法 一、制作标准曲线1.细胞铺板：对收集的细胞悬液进行计数，然后接种细胞；2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔；3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后每100μL培养基加10μL（培养基体积的10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致）。二、细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)；3.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。三、细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；2.向培养板加入不同浓度的待测药物；3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)；5.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。四、计算公式细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 注意事项 1.酚红和血清对CCK-8的检测不会造成干扰，可通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。2.若细胞毒性非常低，加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。3.如果待测物质有氧化性或还原性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。4.加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM将会100%抑制。5.不同的细胞系，加入CCK-8试剂后的反应时间不同，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。6.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔(100μL培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。7.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。同时避免产生气泡，否则会干扰OD值读数。8.白细胞可能需要培养较长时间。9.使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，需要注意蒸发问题，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液。10.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板)：(a).在显色反应后，将培养板放置4°C冰箱内。(b).每孔加10μL0.1MHCl溶液。(c).每孔加10μL1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，反应停止后，应在24小时内测定。11.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 声明 仅用于科研使用，不能用于临床诊断和治疗。 保存条件 4°C避光保存12个月；-20°C避光保存24个月。